Определение количества сперматозоидов

Определение количества сперматозоидов выполняется при микроскопии препарата в счетной камере. Для того, чтобы движения сперматозоидов не вызывали технических сложностей, необходимо провести их обездвиживание. Для этого используется раствор, который содержит 50 грамм бикарбоната соды (NaHCO3), 10 мл 35% раствора формалина, разведенного в 1 литре воды. Это рекомендация ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения). Обездвиживание происходит в камере Горяева. Также возможно использовать один препарат для оценки подвижности сперматозоидов и подсчета концентрации. Для этого после проведения оценки подвижности в тот же препарат вносится 96 процентный раствор этилового спирта, путем поднесения смоченной фильтровальной бумаги к краю покровного стекла камеры.
Иногда используют жидкость Рубенкова, которая состоит из основного фуксина – 0,1 г, красителя Романовского – 0,02 мл, концентрированной карболовой кислоты – 0,2 мл, глицерина – 0,1 мл, этилового спирта ректификата – 2 мл, 1% раствора натрия хлорида – 100 мл. Эта жидкость кроме фиксации окрашивает сперматозоиды, что дает возможность оценить морфологию сперматозоидов – сперматограмму.
Камеру готовят для микроскопии, так же, как было описано ранее. Для более удобного исследования рекомендуется выдержать камеру Горяева во влажной среде специального устройства. Это необходимо для оседания клеточных элементов.
Исследование проводится путем микроскопии световым микроскопом (или фазово-контрастным) при увеличении 200х (объектив 20х и окуляр 10х). Подсчет сперматозоидов происходит внутри квадратов камеры Горяева. Если клетка расположена на границе между квадратами, то пользуются правилом подсчета только на одной стороне камеры (правой или левой). Подсчет проводится сперматозоидов, имеющих головку и жгутик. Если встречаются аномальные сперматозоиды, например, без жгутика, то они в подсчет не входят.
Техника подсчета следующая: если в одном большом квадрате камеры имеется более 40 сперматозоидов, то подсчету подлежат сперматозоиды, находящиеся в пяти больших квадратах; если количество клеток составляет от 10 до 40, то исследуются десять больших квадратов, и если имеется менее чем 10 сперматозоидов, то подсчитываются сперматозоиды, лежащие в 25 квадратах. Принцип подсчета основан на том, что зная все размеры камеры, соответственно ее объем, можно определить концентрацию клеток, находящихся в данном объеме.
Итак, вначале определяется количество малых квадратов, которые расположены в пяти больших. Это число равно 80 (16 х 5 = 80). Далее определяется объем малого квадрата, который составляет 1/4000 кубических миллиметра (V = 0, 05 мм х 0,05 мм х 0,1 мм = 1 / 4000 кубических миллиметра). После чего подсчитывается количество сперматозоидов в одном малом квадрате. Это число делят на число малых квадратов (N / 80). Определяется число сперматозоидов в 1 кубическом миллиметре. Это выполняется так: в 1 кубическом миллиметре объема камеры содержится в 4000 раз больше сперматозоидов, чем в одном малом квадрате. Формула подсчета числа клеток в 1 кубическом миллиметре следующая: C = N х 4000 / 80 = N х 50 (сперматозоидов/кубический миллиметр). Поскольку 1 мл содержит 1000 кубических миллиметра, соответственно количество сперматозоидов в 1 мл определяется по формуле: C (1 мл) = (N х 50) х 10 в 3 степени (сперматозоидов / мл). В конце учитывается степень разведения эякулята: C (общее) = N х 50000 х степень разведения яээкулята.
При проведении подсчетов сперматозоидов в десяти или двадцати пяти больших квадратах следует помнить, что количество малых квадратов будет равно 16 х 10 или 16 х 25. И тогда в формулы подсчета вносятся значения 160 или 400.
Для того чтобы определить концентрацию сперматозоидов во всем эякуляте, необходимо умножить количество клеток в 1 мл эякулята на весь его объем. Для контроля необходимо провести второй подсчет из двух разных порций спермы. Если разница числа сперматозоидов составляет более 5%, то такой результат считают недостоверным и проводят исследование заново.

Дополнительные сведения: нормы концентрации сперматозоидов